1. Les prélèvements tissulaires

Les prélèvements tissulaires sont obtenus soit par biopsie, soit par dissection d'une pièce opératoire ou d'organes.

• Les biopsies

• La biopsie est le prélèvement d'un fragment de tissu durant la vie par diverses méthodes (pinces, trocart, bistouri etc.)
  
  
• La valeur des biopsies à visée diagnostique repose sur:
  - La taille du prélèvement
  - Le nombre de fragments biopsiés
  - La bonne qualité du matériel biopsié, due à l'habileté du préleveur et à la bonne qualité du matériel biopsique: les fragments tissulaires ne doivent pas être écrasés ou étirés
  - La validité des zones biopsiées: les foyers de nécrose ou d'hémorragie ne devraient pas être prélevés
  
  
• Lorsque le prélèvement n'est pas valable pour une étude histopathologique, la biopsie doit être renouvelée
  
  
• L’orientation des prélèvements est souvent nécessaire en cancérologie, pour permettre une étude histopathologique rigoureuse:
  - Les biopsies exérèses, par exemple cutanées, seront orientées, soit par des fils de suture de couleurs différentes, soit par un tatouage à l'encre de chine
  - Les biopsies multiples intéressant plusieurs territoires d'un même organe seront individualisées dans des flacons différents numérotés et répertoriés. Par exemple, pour les biopsies bronchiques: flacon n°1 - éperon lobaire supérieur gauche, 2 fragments; flacon n°2 - bronche lobaire supérieure gauche, 2 fragments.
  
  
• Les prélèvements biopsiques sont étudiés en totalité

• Les pièces opératoires

• Lors de la dissection d'une pièce opératoire, le pathologiste choisit les territoires lui semblant représentatifs des lésions.
  
  
• Les pièces opératoires sont disséquées selon des protocoles précis. Le pathologiste décrit et mesure la tumeur, son extension locale, dénombre les ganglions, recherche les lésions associées, étudie les limites de l'éxérèse, ces limites ayant au préalable été repérées par le chirurgien (fils de suture de couleurs différentes, tatouage à l'encre de chine). Cet examen macroscopique oriente le choix et le nombre des zones qui seront prélevées pour l'étude histopathologique. Une photographie macroscopique de la pièce opératoire peut être réalisée dans la majorité des laboratoires.

2. La fixation (Tableau I)

La fixation, étape essentielle dans la préparation tissulaire, est en fait sous la responsabilité du clinicien. Son but est de s'opposer à l'autolyse tissulaire et de conserver aux tissus une structure la plus proche possible de la structure "in vivo".

• La fixation se fait par immersion du prélèvement dans un liquide fixateur et répond à des règles strictes qui motivent le transfert rapide des prélèvements vers le laboratoire d'anatomie pathologique. Elle doit:

• être immédiate
• se faire dans un volume suffisant de fixateur correspondant à 10 fois le volume de la pièce opératoire
• être brève pour éviter la rétraction cellulaire et tissulaire. Une fixation prolongée est l'obstacle majeur aux techniques d'immunohistochimie. La durée de la fixation dépend de la taille du prélèvement: 1 à 5 heures pour une biopsie, 24 heures pour une pièce opératoire.

• Il n'existe pas de fixateur universel, idéal. Deux types de fixateurs sont habituellement utilisés:

• Les solutions de formol à 10 % permettent l’utilisation des tissus fixés pour l’immunohistochimie, les techniques de biologie moléculaire ou de cytométrie en flux
• Le liquide de Bouin aqueux ou alcoolique permet une bonne analyse morphologique. Le liquide de Bouin peut être utilisé pour l'immunohistochimie, mais n'est pas recommandé pour les techniques de biologie moléculaire.
• D'autres méthodes de conservation des tissus sont parfois nécessaires en pathologie, ainsi la congélation à -180°C (azote liquide) d'un fragment de tumeur, en particulier en pathologie hématologique

3. La partition du prélèvement tissulaire

Des approches méthodologiques autres que l'examen histopathologique standard sont parfois utiles à partir des prélèvements tissulaires. Ces méthodes sont l'immunohistochimie, l'histochimie, la cytométrie en flux, la microscopie électronique, l'analyse cytogénétique ou la biologie moléculaire. Leur choix nécessite d'adopter un protocole de gestion bien déterminé et une stratégie de partition des tissus pour les différentes techniques (Tableau I).

4. La méthode standard en histopathologie

Le but est d'obtenir une section tissulaire fine, pour pouvoir être traversée par la lumière, et colorée, car les tissus sont incolores, pour être observée au microscope optique (grandissement de 20 à 1000).

• Les fragments tissulaires sont deshydratés avant d'être inclus en paraffine (blocs d’inclusion). Des coupes fines (4 m) sont obtenues à l'aide d'un microtome. Ces coupes, collées à des lames de verre, sont colorées par l'hématéine éosine.

• L'automatisation d'une partie des manipulations a permis de réduire la durée de la technique. Cependant, un minimum de 24 heures pour une biopsie et de 48 heures pour une pièce opératoire correspond au délai incompressible de la technique. Le degré variable de difficulté d'interprétation des lésions et la nécessité de faire appel à des techniques spéciales allongent les délais jusqu'à 6 à 10 jours.

5. L'examen extemporané

L'examen extemporané est un examen d'orientation proposant un diagnostic de présomption. Effectué au cours de l'intervention chirurgicale, il apporte, en quelques minutes, une orientation diagnostique et sera obligatoirement complété par l'inclusion en paraffine du fragment tissulaire examiné extemporanément. Les techniques utilisées en examen rapide altèrent la morphologie tissulaire et rendent difficiles l'analyse ultérieure après fixation et inclusion.

• Indications
  L’examen extemporané est indiqué lorsque la réponse du pathologiste conditionne un choix immédiat entre deux gestes thérapeutiques chirurgicaux. Il peut s'agir, soit d'un diagnostic de cancer, par exemple en pathologie mammaire, soit de l'étude des limites de l'éxérèse, en fait rarement justifiée sauf dans des cas très spécifiques, par exemple les tumeurs cutanées de la face ou les tumeurs des tissus mous.

• Limites

• Certaines tumeurs sont de diagnostic difficile voire impossible en technique rapide, par exemple les tumeurs du tissu lymphoïde ou les tumeurs osseuses
• Les tumeurs de petite taille (inférieure à 1 cm) seront de diagnostic difficile en examen extemporané et l'analyse finale sera gênée par les altérations tissulaires liées à la congélation
• L’étude extemporanée des limites d’éxérèse donne parfois une fausse sécurité
• De même l'étude extemporanée des ganglions pour la poursuite du curage ganglionnaire des tumeurs solides risque d'ignorer les micro-métastases et ne tient pas compte du fait que la dissémination métastatique peut sauter des relais ganglionnaires.

1. Les différents types de prélèvements

Différents types de prélèvements cytologiques sont soumis au pathologiste: leurs techniques d’étude sont différentes. Ce sont:

• Les liquides (LCR, urines, épanchements pleuraux, ascite, kystes, etc.) et les écoulements (sein essentiellement)

• Les lésions solides prélevées soit par ponction à l’aiguille avec ou sans aspiration, soit par empreintes, grattages, brossages et frottis (ganglions, muqueuses respiratoires ou digestives supérieures, génitales féminines [frottis cervico-vaginaux] et masculines, maladie de Paget du mamelon, lésions cutanées, etc.)

2. Origine des prélèvements cellulaires

Les prélèvements peuvent provenir de tissus ou organes:

• Soit superficiels accessibles: grattages, empreintes et frottis, ponction à l’aiguille fine, directe ou guidée en cas de lésion infraclinique par échographie, stéréotaxie, scanner, voire amplificateur de brillance

• Soit profonds et un repérage ou un guidage est alors nécessaire dans la plupart des cas. Des prélèvements cytologiques peuvent être obtenus au cours des explorations endoscopiques dont la fréquence augmente avec les techniques “non invasives” de diagnostic et de traitement.

3. Transmission des prélèvements

• Les liquides sont transmis tels quels au pathologiste qui les centrifuge, étale sur lames ou inclut en paraffine le culot de centrifugation

• Les produits de ponctions, empreintes, frottis seront étalés sur lames propres et sèches

• L’étalement est un temps capital de la cytologie et doit être parfaitement maitrisé par le préleveur: étalement du produit de ponction déposé à une extrémité de la lame avec une autre lame, d’une manière uniforme, sans retour en arrière, en dissociant sans écraser les placards cellulaires pour obtenir un étalement en couche monocellulaire

• La fixation, simple séchage à l’air, à la laque ou à l’alcool, est sous la responsabilité du préleveur en fonction des souhaits ou recommandations du pathologiste

1. Compte-rendu histo-cyto-pathologique

• Le compte-rendu anatomo-cyto-pathologique est un document de communication entre clinicien et pathologiste. Il comporte une description et une conclusion.

• La conclusion doit être claire et précise. Elle indiquera, par exemple, pour une tumeur:

• La dénomination précise proposée par une classification internationale, par exemple de l'OMS
• Le caractère bénin ou malin
• L'histogénèse
• La différenciation du cancer
• Pour certains cancers, le grade et/ou le stade dont les références seront citées

• D'autres informations seront signalées selon le type de prélèvement:

• Biopsie exérèse: taille de la tumeur, sa distance par rapport aux différentes limites de résection
• Pièce opératoire: la conclusion doit apporter les éléments aidant à l'évaluation du stade clinique: taille de la tumeur, extension locale, état des limites de résection, nombre de ganglions métastatiques
• Prélèvement cytopathologique: le compte-rendu doit signaler la cellularité du prélèvement. Si celle-ci est insuffisante ou de mauvaise qualité, aucune conclusion ne doit être donnée, en dehors de “prélèvement non significatif” sans valeur. Il faut éviter les termes de “prélèvement positif”, et surtout “prélèvement négatif” qui peut signifier “sans élément malin” ou “sans élément significatif”.

• Le compte-rendu cytologique a ses “limites” par rapport au compte-rendu histologique car il manque les arguments d’architecture, les relations cellules épithéliales - tissu conjonctif, et donc le caractère in situ ou invasif d'un carcinome.

2. Les consultations inter-pathologistes

L'avis de consultants est plus facile à obtenir en pathologie que dans les autres disciplines en raison de la facilité d'adresser des lames ou des blocs d'inclusion. Cette circulation de prélèvements tissulaires et cellulaires est actuellement courante et se fait de pathologiste à pathologiste. Ces consultations peuvent être demandées pour plusieurs raisons:

• Incertitude diagnostique ou discordance entre plusieurs pathologistes du même centre
• Transfert du patient dans un autre hôpital
• Le patient, ou le clinicien, demande un deuxième avis

1. Immunohistochimie

L’immunohistochimie est une méthode de détection d’une protéine sur coupe tissulaire ou sur un étalement cytologique. Cette détection se fait à l’aide d’un anticorps, révélé par une réaction colorimétrique enzymatique ou par une substance fluorescente. L’immunohistochimie est en fait une réaction immunologique in situ et son interprétation est associée à une analyse morphologique. Elle est la seule méthode, parmi les autres méthodes immunologiques, permettant de préciser le type de la cellule contenant le signal et la topographie du signal dans la cellule.

• Méthodologie

• Tissu fixé et inclus en paraffine
  La résistance partielle des protéines à la fixation et à l’inclusion en paraffine permet de détecter une partie des protéines sur le matériel usuel d’anatomie pathologique. La fixation est l’étape la plus importante pour la préservation des antigènes. Les fixateurs agissent en modifiant la structure des protéines. L’effet nocif des fixateurs est limité par une durée brève de la fixation. L’activité antigénique peut être partiellement restaurée par l’action d’enzymes protéolytiques ou de la chaleur (micro-ondes).
  
  
• Tissu congelé
  La congélation permet la conservation optimale de la majorité des protéines. Le fragment tissulaire congelé à -180°C (azote liquide) est conservé soit à -180°C, soit à -60°C. Les avantages de la congélation sont la préservation de la plupart des protéines. Les inconvénients sont une morphologie cellulaire médiocre et la nécessité de prévoir la congélation avant le geste biopsique ou opératoire.

• Indications de l’immunohistochimie en pathologie tumorale

L’indication essentielle actuelle est l’aide au diagnostic. Si les informations sur l’étude fonctionnelle des cancers n’ont pas actuellement de valeur pronostique clairement définie, ces informations sont essentielles pour la compréhension de la biologie des tumeurs. L’immunohistochimie est une technique performante pour déterminer l’expression des protéines dans les cellules cancéreuses ou dans le stroma.

• Aide au diagnostic
  Méthode performante, complémentaire de l’analyse morphologique, ses indications sont en fait peu nombreuses, non systématiques et limitées à un nombre restreint de cas, environ 5 à 10 % des tumeurs. Les indications et le choix des anticorps sont déterminés par le pathologiste en fonction de l’aspect morphologique et des informations cliniques.
  
  
• Classification des cancers indifférenciés (Tableau II)
  La classification des cancers indifférenciés représente l’indication essentielle de l’immunohistochimie. Un diagnostic précis est souvent nécessaire en raison de stratégies thérapeutiques différentes selon les types de cancer. La différenciation cellulaire se traduit par l’expression de protéines particulières à ces cellules et la détection de ces protéines permet d’évoquer l’origine de la cellule cancéreuse. Un nombre restreint d’anticorps permet une orientation histogénétique dans la majorité des cas, sur tissu fixé et inclus en paraffine. Il reste néanmoins des tumeurs inclassables, soit parce que les cellules tumorales n’expriment pas de molécules actuellement reconnues, soit parce qu’elles expriment de façon inhabituelle des molécules présentes normalement dans d’autres types cellulaires (exemple: certains lymphomes malins contiennent des kératines).
  
  
• Diagnostic entre lésion bénigne et cancer
  L’immunohistochimie apporte rarement des renseignements utiles sauf dans un nombre restreint de situations. Par exemple, dans un ganglion, la distinction entre lésion bénigne et lymphome malin B peut être facilitée par l’identification d’une seule chaîne légère d’immunoglobuline suggérant le caractère clonal et tumoral de la population lymphoïde. En fait, dans la majorité des tumeurs, ce diagnostic différentiel repose sur la seule analyse histopathologique.
  
  
• Etude fonctionnelle et pronostique des tumeurs
  - Prolifération cellulaire
  Des anticorps ont été obtenus permettant d’identifier des protéines intervenant dans le contrôle du cycle cellulaire. La détection immunohistochimique de ces protéines (PCNA, Ki-67, p53) permet d’apprécier le nombre des cellules engagées dans le cycle cellulaire. De même, la détection par immunohistochimie de facteurs de croissance, de produits d’oncogènes ou d’anti-oncogènes, de molécules de résistance à la chimiothérapie ou de molécules d’adhésion est un élément important pour la compréhension de la biologie tumorale. Seules de très rares molécules ont une valeur pronostique démontrée (exemples: bcl-2 et survivine dans les lymphomes diffus à grandes cellules B).
  - Récepteurs hormonaux
  L’étude des récepteurs aux oestrogènes et à la progestérone dans les cancers du sein a prouvé son intérêt pour l’évaluation du pronostic et le traitement du cancer du sein. L’immunohistochimie sur coupes de tissus fixés et inclus en paraffine, ou sur ponctions cytologiques, représente une méthode de choix pour la détection des récepteurs, en particulier dans les cancers de petite taille, les biopsies à l’aiguille ou les études rétrospectives. Parce qu’elle est associée à une analyse morphologique, cette méthode permet d’individualiser la présence des récepteurs dans les cellules tumorales.

2. Application des techniques de biologie moléculaire en histopathologie

Les progrès réalisés en biologie moléculaire ont permis le transfert des techniques moléculaires à l’étude des tissus. Deux types de techniques sont utilisés à partir d’un matériel tissulaire: l’hybridation in situ basée sur l’observation microscopique du signal; les techniques réalisées à partir d’extractions d’acide nucléique.

• Hybridation in situ

L’hybridation in situ sur coupe tissulaire correspond à la détection microscopique d’un signal d’hybridation entre une sonde marquée et un acide nucléique, ADN ou ARN. L’hybridation in situ est la seule technique de biologie moléculaire permettant de localiser les acides nucléiques dans les différents territoires d’un tissu ou d’une cellule et de préciser le type de la cellule contenant le signal.

• Méthodologie
  - Les sondes
  Les différents types de sondes utilisées en biologie moléculaire peuvent être appliquées en hybridation in situ : sondes ADN, ribosondes, oligonucléotides de synthèse. Les sondes sont marquées soit par un isotope radio-actif (P³³, S³⁵, H³) révélé par autoradiographie, soit par une molécule non isotopique visualisée par un fluorochrome ou par une réaction colorée visible au microscope optique standard.
  - Préparation tissulaire et cellulaire
  La congélation d’un fragment tissulaire permet une excellente conservation des ADN et des ARN cellulaires. En revanche, les acides nucléiques sont, comme les protéines, partiellement masqués ou détruits par la fixation et l’inclusion en paraffine. La conservation des acides nucléiques dépend essentiellement du choix du fixateur.
  
  
• Applications en oncologie
  L’hybridation in situ est utilisée de façon extensive pour la compréhension de la biologie tumorale. En revanche, les indications diagnostiques sont réservées à un nombre limité de cas. Les applications au diagnostic sont:
  - La détection d’ADN ou d’ARN viral
  La détection du virus d'Epstein Barr (EBV) est utile dans quelques rares cas de pathologie tumorale : carcinome indifférencié du naso-pharynx, lympho-prolifération post-transplantation. Les différents sous-types de papillomavirus ont été étudiés de façon extensive dans les néoplasies intra-épithéliales du col utérin.
  - La détection des ARN messagers cellulaires
  L’étude des ARN messagers dans un but diagnostique n’a pas prouvé sa supériorité par rapport à la détection immunohistochimique de la protéine correspondante. Actuellement, l’indication diagnostique reste limitée (ARN messagers des chaînes légères Kappa et Lambda des immunoglobulines).
  - La détection des altérations génétiques au cours des cancers
  Des modifications génétiques, telles les translocations, peuvent être actuellement détectées par hybridation in situ dans les noyaux des cellules interphasiques. Ces méthodes sont utilisées en cytogénétique, sur des préparations cytologiques, à l’aide de fluorochromes (technique FISH). Des techniques plus complexes peuvent également être utilisées: hybridation génomique comparative (CGH), caryotype spectral (SKY), biopuces (DNA-chips).

• PCR : Amplification élective in vitro de séquences d’acides nucléiques

La technique de PCR permet d’amplifier in vitro, en très grande quantité, une séquence d’acide nucléique (ADN) dont on connait les deux extrémités. Il est donc possible par cette technique d’analyser de façon fine n’importe quel fragment d’ADN, voire d’ARN, après une étape préalable de transcription inverse d’un ARN en ADN. De par sa capacité à amplifier spécifiquement une très faible quantité d’ADN, cette technique est tout particulièrement appropriée à l’analyse de sections tissulaires ou de culots cellulaires.
En anatomie pathologique, à partir d’un fragment tissulaire analysé sur le plan morphologique et immunohistochimique, il sera possible d’extraire de l’ADN sur des coupes sériées et ainsi d’analyser certaines séquences d’acides nucléiques. Des recherches visent actuellement à développer les techniques de PCR in situ ou de RT PCR in situ pour rechercher des séquences d’ADN ou d’ARN après amplification directe des coupes tissulaires sans extraction préalable d’ADN du tissu, mais les résultats sont peu reproductibles. Des techniques de microdissection-laser, suivies d'extractions d'acides nucléiques, sont préférées.

• Méthodologie
  Les techniques de PCR consistent le plus souvent à extraire dans un premier temps de l’ADN double brin à partir de coupes tissulaires que l’on aura au préalable analysées sur le plan morphologique.
  Extraction d’ADN à partir des tissus et des cellules: Les coupes de tissu congelé et les culots de cytocentrifugation permettent de garantir une bonne qualité d’extraction d’ADN. Cependant les coupes de tissu fixé au formol et inclus en paraffine peuvent donner des résultats tout à fait interprétables même si les ponts nucléoprotéiques induits par la fixation rendent difficiles l’extraction d’ADN et l’accessibilité à la matrice nucléique. En revanche, le liquide de Bouin entraîne, en plus des ponts nucléoprotéiques, des cassures de l’acide nucléique rendant les résultats de la PCR aléatoires: seul un résultat positif est à prendre en compte.
  
  
• Applications en anatomie et cytologie pathologiques des tumeurs
  Les principales applications de la PCR à partir d’acides nucléiques extraits de culots cellulaires ou de coupes tissulaires concernent l’étude de réarrangement de gènes, la recherche de mutation, d’expression de gènes, d’ADN ou d’ARN viral.
  - Réarrangement de gènes
  C’est surtout dans cette application que les techniques de PCR ont pris une place importante en diagnostic des tumeurs hématopoïétiques. En effet, il est possible par PCR de rechercher les réarrangements des gènes du récepteur T et des immunoglobulines, permettant d’étudier la clonalité d’une population lymphoïde B ou T. Cette technique est d’un apport considérable dans les rares cas où le diagnostic histopathologique est difficile entre une hyperplasie lymphoïde et un lymphome malin; il est toutefois fondamental de savoir que les techniques de PCR, si sensibles soient-elles, n’étudient pas toutes les possibilités de réarrangement de gènes. Ainsi, un résultat négatif en PCR n’élimine pas un authentique lymphome malin. Enfin, l’existence d’une monoclonalité en PCR n’est pas automatiquement synonyme de malignité. C’est pourquoi il est fondamental d’intégrer les données de la génétique moléculaire aux données cliniques, morphologiques et immunophénotypiques.
  - Recherche de mutations
  Les techniques de PCR en utilisant des techniques fines d’analyse de produits d’amplication (DGGE ou SSCP) peuvent permettre sur coupes tissulaires de rechercher des mutations sur les “points chauds” (sites les plus fréquents de mutations) des exons de certains oncogènes ou antioncogènes (ras, p53, Rb...).
  - Expression de certains gènes
  En utilisant une phase préalable de transcription inverse, il est possible d’étudier l’expression de certains oncogènes au sein d’une tumeur.
  - Recherche d’ADN ou d’ARN viral
  Il est possible par PCR d’analyser la présence d’un génome viral ou de ses transcrits au sein d’une tumeur. Cependant, ces techniques sont souvent moins intéressantes que l’hybridation in situ qui permet de visualiser au sein de quelles cellules les génomes ou les transcrits viraux sont présents.

3. Etude de l'ADN et de la prolifération cellulaire

L’activité proliférative d’une tumeur peut être étudiée par différentes méthodes, telles la quantification de l’ADN dans les cellules tumorales, la détection d’une protéine présente dans les cellules en cycle ou l’incorporation “in vivo” ou “in vitro” de pyrimidines modifiées, par exemple la bromodéoxyuridine (BrdU) appariée à l’adénosine au cours de la réplication de l’ADN. Ces méthodes permettent de chiffrer le pourcentage de cellules en cycle. La dernière peut fournir des informations sur la vitesse de la prolifération cellulaire. Ces études sont réalisées soit sur les cellules en suspension analysées en cytométrie en flux, soit sur des étalements cytologiques ou des coupes tissulaires, analysées en microscopie optique en particulier par des systèmes d’analyse d’image.

• Méthodes

• Cytométrie en flux
  La quantification de l'ADN, évaluée après incorporation d'iodure de propidium, est exprimée en histogrammes d'ADN. Deux types de paramètres sont mesurés à partir de ces histogrammes:
  - La quantité d'ADN ou ADN ploïdie. Celle-ci est soit équivalente à celle de cellules normales, ADN diploïdie, soit anormale, ADN aneuploïdie.
  - L'analyse de la cinétique cellulaire est obtenue à partir des histogrammes d'ADN. Le pourcentage de cellules engagées dans le cycle, en phase de synthèse d'ADN (phase S), permet d'évaluer l'activité proliférative de la tumeur.
  
  
• Cytométrie à balayage par analyse d’image
  La cytométrie à balayage par analyse d'image se caractérise par la digitalisation des images observées au microscope et par l'étude automatisée de l'image colorée du noyau permettant d'analyser plusieurs paramètres de quantité d'ADN et de cinétique cellulaire sur 300 à 600 cellules par lame.

• Les applications en oncologie

• Valeur diagnostique
  L’étude de l’ADN a peu de valeur dans le diagnostic différentiel entre lésion bénigne et cancer. Il existe des populations aneuploïdes dans des lésions bénignes et certains cancers sont en majorité diploïdes.
  
  
• Intérêt pronostique
  La valeur pronostique de l’ADN ploïdie, utilisée seule, est limitée. En revanche, l’association de l’ADN ploïdie et du pourcentage de cellules en phase S fournit des informations sur la cinétique de croissance tumorale et pourrait apporter des éléments pronostiques.